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技術(shù)文章 / article
慢病毒整合插入位點標準品擴容
原載自：m.bchzp.com[技術(shù)資料頻道] 2025-05-30 瀏覽次數(shù)：43
慢病毒背景
慢病毒載體（Lentiviral vectors, LVs）是在人免疫缺陷病毒HIV-1的基礎(chǔ)上改造而來的，可以將大量的遺傳信息傳遞進宿主細胞，并且整合到細胞的基因組內(nèi)，使其可以在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達若干代。同時，由于它的毒力基因已經(jīng)被剔除，作為假病毒可以在實驗室內(nèi)較為安全的使用。慢病毒載體可以轉(zhuǎn)染多種細胞，包含原代細胞等難轉(zhuǎn)染的細胞。
慢病毒在Car-T細胞療法中的應(yīng)用
基于慢病毒具有：
感染范圍廣、效率高，有效感染分裂和非分裂的細胞；
穩(wěn)定性強，整合進基因組中，長期穩(wěn)定表達外源的基因；
免疫原性低，安全性相對較高的特點，慢病毒被廣泛應(yīng)用于細胞治療中。
CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-cell，嵌合抗原受體T細胞）療法是一種突破性免疫療法，通過基因改造患者的T細胞，使其表達特定的CAR（嵌合抗原受體），從而識別并殺傷腫瘤細胞。目前主要用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤（如B細胞白血病、淋巴瘤），并逐步向?qū)嶓w瘤拓展。
慢病毒整合的特性
慢病毒是目前CAR-T主流轉(zhuǎn)導方式（FDA已批準的CAR-T產(chǎn)品中，約90%采用LV），慢病毒整合在細胞內(nèi)是半隨機整合（偏好轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)）。
1
慢病毒通過識別宿主表面受體，把RNA和蛋白轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)；
2
病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄形成線性 雙鏈cDNA（含兩端LTR序列）
3
整合酶識別LTR,cDNA被整合到宿主基因組中；
4
外源基因隨宿主細胞分裂持續(xù)表達。
整合偏好性：
整合位點分析（Integration Site Analysis, ISA）是基因治療產(chǎn)品（如CAR-T）臨床開發(fā)和上市后監(jiān)測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其法規(guī)要求由各國監(jiān)管機構(gòu)（如FDA、EMA）制定，旨在評估基因組整合的潛在風險（如插入突變、克隆擴增）。
目前檢測ISA的方法有LM-PCR、NGS、單細胞測序等，為了保證檢測的準確性，科佰生物開發(fā)了一系列慢病毒整合位點標準品供檢測機構(gòu)使用，作為品質(zhì)衡量的標尺對檢測能力進行判別。在前文 慢病毒整合位點標準品強勢來襲一文中，已對單克隆多插入位點、單克隆單插入位點、性染色體插入位點 做了產(chǎn)品的說明及數(shù)據(jù)展示。近期科佰推出了5% 2% 整合頻率的慢病毒多克隆多整合位點參考品，由多個單克隆整合位點產(chǎn)品混合而來，覆蓋20個插入位點，分別來自11個不同染色體上的20個基因，如下表所示
Figure 1. 基因分布
Figure 2. 染色體分布
每個位點經(jīng)過LM-PCR（用于識別已知DNA與相鄰未知DNA的一種技術(shù)，可結(jié)合NGS，對IS進行高通量分析）、 NGS（捕獲探針法測序）技術(shù)檢測，Sanger測序驗證，以及dPCR檢測定標整合頻率，確保插入位點的準確定位和整合頻率的精準測量。
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產(chǎn)品列表
貨號 | 名稱 |
CBPL0007 | 慢病毒多克隆多整合位點參考品-5% |
CBPL0008 | 慢病毒多克隆多整合位點參考品-2% |
部分數(shù)據(jù)展示：
5% chr3：4871944 ITPR1四種檢測結(jié)果：
LM-PCR結(jié)果
NGS結(jié)果
Sanger結(jié)果
3'LTR+ITPR1 chr3_4871940
ITPR1 chr3_4871944+5'LTR
dPCR結(jié)果
