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技術(shù)文章 / article
DPCR檢測試劑盒開發(fā)性能驗(yàn)證
原載自：m.bchzp.com[技術(shù)資料頻道] 2025-04-27 瀏覽次數(shù)：122
描述
數(shù)字PCR（DPCR）是一種核酸定量技術(shù)，能夠在單分子水平上對DNA或RNA進(jìn)行絕對定量。與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）相比，DPCR具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，因此在生物學(xué)研究和臨床診斷中得到了廣泛應(yīng)用。
DPCR腫瘤領(lǐng)域相關(guān)應(yīng)用
DPCR腫瘤領(lǐng)域相關(guān)應(yīng)用：
檢測Gene Expression，主要是檢測mRNA的定量分析;
檢測Mutation（SNV和Indel），可以檢測拷貝數(shù)，也可以檢測比率；
檢測CNV（拷貝數(shù)變異分析），相對定量；
檢測Fusion，可以檢測拷貝數(shù)，也可以檢測比率；
科佰生物
科佰生物針對以上應(yīng)用開發(fā)對應(yīng)的檢測試劑盒，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價(jià)，如下我們以EGFR T790M為例：
實(shí)驗(yàn)一：LOB空白限測試
待測樣本：20個(gè)陰性樣本和1個(gè)NTC。分別將投入量設(shè)置為10ng和40ng，每個(gè)樣本做兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行Bio-Rad數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：無論是10ng還是40ng，LOB控制在2拷貝以內(nèi)（一般噪音拷貝為5以內(nèi)），雜點(diǎn)不呈現(xiàn)劑量的依賴，是隨機(jī)產(chǎn)生的噪音信號。
實(shí)驗(yàn)二：準(zhǔn)確性測試
待測樣本：10個(gè)NGS驗(yàn)證為陽性的樣本（編號1-10）; 10個(gè)NGS驗(yàn)證為陰性的樣本（編號11-20）。對20個(gè)樣本分別使用數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：
①測試10個(gè)NGS陽性樣本,檢測結(jié)果均為陽性，陽性符合率100%，并定量檢出變異頻率。
②測試10個(gè)NGS陰性樣本,檢測結(jié)果均為陰性，陰性符合率100%，定值變異頻率均為0%。
實(shí)驗(yàn)三：線性范圍測試
1、投入量與拷貝數(shù)、頻率之間的線性測試
首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標(biāo)準(zhǔn)品(CBP10402)，該標(biāo)準(zhǔn)品是通過基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經(jīng)過理論值計(jì)算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗(yàn)證，確認(rèn)為50%的頻率。
1.1 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個(gè)梯度，進(jìn)行數(shù)字PCR檢測（2復(fù)孔），分別考量FAM拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān)、VIC拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān)；
1.2 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個(gè)梯度，進(jìn)行數(shù)字PCR檢測（2復(fù)孔），判斷是否滿足%AF=50±10%波動。
由上數(shù)據(jù)可見：
①200 ng投入量過大，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性，雖然滿足45-55%范圍，但是不適合做單一通道的拷貝數(shù)判定；
②0.1 ng投入量過小，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性，同時(shí)42.59%也低于45%，不適合做單一通道，也不適合做雙通道；
因此：范圍為0.5-100ng。
2、線性稀釋不同頻率理論值與檢測值的線性測試
根據(jù)以上結(jié)論，我們選取10ng作為進(jìn)一步的%AF線性范圍探索，首先使用EGFR T790M的對應(yīng)的陰性標(biāo)準(zhǔn)品，對50%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋，0.1%-50%間設(shè)置9個(gè)AF梯度，進(jìn)行數(shù)字PCR檢測（2復(fù)孔）。
由上數(shù)據(jù)可見：在10ng的投入量下，AF%呈現(xiàn)非常好的線性稀釋，存在波動，但是都在誤差范圍內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)四：檢測限測試
我們可以通過理論計(jì)算來預(yù)測下可能的檢測限范圍。當(dāng)控制拷貝在15000（對應(yīng)50ng input）以內(nèi)時(shí)LOB數(shù)據(jù)是2，2/15000=0.0133%，預(yù)測檢測限為0.0200%。
在如此低頻的情況下，臨床適用場景適合ctDNA，一般來說臨床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng，取低值20ng。20ng 理論值6000個(gè)拷貝數(shù)，2/6000=0.0333%，預(yù)測檢測限為0.0500%。
0.05%的誤差范圍是±50%，就是0.025-0.075%，因此我們選擇3個(gè)點(diǎn)，探尋LOD分別為 0.010%、0.050%、0.100%，要求95%檢出。
0.010%
對20個(gè)0.01%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.005-0.015%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。
0.05%
對20個(gè)0.05%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.025-0.075%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。
0.1%
對20個(gè)0.1%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.05-0.15%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。
由上數(shù)據(jù)可見：選擇0.05%作為該檢測試劑盒的檢測限LOD。
實(shí)驗(yàn)五：精密度測試
選取強(qiáng)陽性2%樣本20個(gè)，中陽性1%樣本20個(gè)，弱陽性0.2%樣本20個(gè)分別進(jìn)行數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：強(qiáng)陽性2% 、中陽性1% 、弱陽性0.2%三種檢測體系下，誤差均在合理的范圍內(nèi)，精密度良好。
實(shí)驗(yàn)六：回收率測試
首先使用EGFR T790M的對應(yīng)的陰性標(biāo)準(zhǔn)品，對50%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋，每個(gè)梯度使用陰性樣本兩倍稀釋，接著對11個(gè)樣本進(jìn)行檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：當(dāng)AF在0.05%-50%范圍內(nèi)，對應(yīng)的回收率在80-120%范圍，符合預(yù)期。
實(shí)驗(yàn)七：重復(fù)性測試
取10個(gè)不同AF（1%~50%）的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，分別安排實(shí)驗(yàn)員A、實(shí)驗(yàn)員B在同一天，每人進(jìn)行四次檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復(fù)的檢出的。
實(shí)驗(yàn)八：重現(xiàn)性測試
取10個(gè)不同AF（1%~50%）的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，分別安排①實(shí)驗(yàn)員A、實(shí)驗(yàn)員B在同一天進(jìn)行每人四次實(shí)驗(yàn)測試；②實(shí)驗(yàn)員A在第一天、第二天分別進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測試；③實(shí)驗(yàn)員A在第一天進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測試，實(shí)驗(yàn)員B在第二天進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測試。
由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復(fù)的在不同人、不同時(shí)間檢出，重現(xiàn)的。
科佰生物已經(jīng)開發(fā)了多款dPCR試劑盒檢測體系，并利用自身的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了性能驗(yàn)證?？捎糜诨蛲蛔儯诤?，拷貝數(shù)變異等的檢測。同時(shí)，我們可以提供dPCR檢測的科研服務(wù)，基于其絕對定值、精準(zhǔn)定量的強(qiáng)大優(yōu)勢，為客戶的樣本檢測提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)。
